Cd2+作为水中主要的重金属污染物，因其长半衰期和高毒性影响着甲壳动物发育生长。它可以随动物呼吸在鳃中富集并导致细胞产生活性氧，从而对甲壳类动物造成氧化应激和组织病理学损伤。因此寻找金属免疫基因并深度探究其免疫调节机制是提高甲壳动物抗应激能力和产量的首要研究目标。
张继泉/孙玉英课题组以发掘抗金属调节基因为目的，利用RNA-seq和分子对接技术在中华锯齿米虾中发现了一条膜结合型海藻糖酶基因（NdTre2）。它是几丁质合成途径中的第一个酶，还可以通过水解一分子海藻糖为两分子葡萄糖为机体提供能量。海藻糖是昆虫的血糖，Tre主要表达于昆虫的消化循环系统中。作为控制害虫的靶点，敲降Tre2会导致幼虫摄食量减少、化蛹异常以及死亡率上升。而在血糖为葡萄糖的中华锯齿米虾中，我们发现NdTre2主要表达于鳃组织中并行使免疫功能，且培养于Cd2+环境中NdTre2表达水平显著下降。对敲降NdTre2后12 h的鳃转录组分析发现，基因敲降会导致合成20E通路中的差异基因表达上调，细胞凋亡通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中差异基因被激活。利用TUNEL和DAPI染色我们对鳃中细胞凋亡现象进行了验证。在体外对重组表达NdTre2和EGFP的大肠杆菌进行Cd2+胁迫后发现，相比于对照组，表达NdTre2可提高大肠杆菌响应胁迫时的存活率和繁殖速度。这些结果表明，当中华锯齿米虾受到Cd2+胁迫后，会通过降低NdTre2的表达，促进蜕皮激素合成并增加细胞凋亡的方法维持机体稳态。总之，这项研究为探究甲壳动物应对不利环境胁迫时的响应机制提供了基础研究。
上述成果近期发表在Science of The Total Environment上。河北大学2021级博士研究生吴紫暄为论文第一作者，张继泉研究员和孙玉英教授为论文通讯作者，相关研究得到国家自然科学基金、河北省重点研发计划和河北省自然科学基金等资助。
论文信息：Wu ZX, Yan CC, Xing KF, Liu YJ, Zhang CY, Li HM, Sun YY*, Zhang JQ*. 2024. Membrane-bound trehalase enhances cadmium tolerance by regulating cell apoptosis in Neocaridina denticulata sinensis. Science of The Total Environment （中科院一区TOP，IF 9.8），Doi: 10.1016/j.scitotenv.2024.173798
图1 不同物种中Tre2序列比对。（A）多物种Tre2蛋白序列比对进化树。（B）多物种Tre2功能域和甘氨酸序列比对图。
图2 NdTre2表达谱。（A）组织表达谱。（B）Cd2+刺激后NdTre2在鳃中表达谱。
图3 重组NdTre2的验证和酶活测定。（A）咪唑梯度洗脱重组NdTre2胶图。（B）最适pH测定。（C）最适温度测定。（D）蛋白热稳定性测定。（D）金属对酶活性的影响。
图4 不同浓度双链注射后鳃中NdTre2的敲降效率
图5 差异基因分析。（A）差异基因热图。（B）差异基因的定量验证。（C）差异基因火山图。（D）差异基因的GO注释。（E）差异基因的KO富集。（F）上调差异基因的KEGG注释。（G）下调差异基因的KEGG注释。
图6 不同蜕皮周期中NdTre2在头胸甲、腹足和尾扇外骨骼中的表达。
图7 分子水平上的细胞凋亡验证。（A）凋亡相关通路中差异基因定量验证。（B）DNA ladder可视化图片。
图8 被激活的caspase通路和MAPK通路
图9 TUNEL/DAPI染色后鳃中凋亡细胞
图10 斑点实验验证NdTre2对大肠杆菌的金属保护性
图11 Cd2+刺激下的大肠杆菌存活率
